CRISPR, la nueva herramienta de modificación genética: demasiado rápido por comodidad

Una nueva técnica de edición de los genes nos ha pillado desprevenidos. Permite desactivar o modificar determinados genes específicos del genoma de los animales, incluidos los seres humanos, de una forma más rápida y eficiente de lo que se había hecho hasta ahora, pero plantea serias preocupaciones éticas y sobre su seguridad, dice la Dra. Mae-Wan Ho.

Por la Dra. Mae-Wan Ho, 12 de enero de 2016

iSiS

La nueva técnica de edición de genes (véase el recuadro) [1] nos ha pillado desprevenidos. Permite a los genetistas desactivar o modificar una secuencia específica de genes en la práctica totalidad de los animales, incluidos los seres humanos, de una forma mucho más rápida y más eficientemente de lo que se venía haciendo hasta ahora, asegurando que mejorará nuestra comprensión del funcionamiento de los genes, eliminando aquellos genes que causan enfermedades, incluso modificando el genoma de los embriones humanos para erradicar ciertas enfermedades o su mejora. Las aplicaciones avanzan tan rápidamente que muchos científicos han hecho un llamamiento a la prudencia para que se actúe con mayor seguridad y al mismo tiempo se aborden las preocupaciones éticas.

El asunto ha llegado a un punto crítico cuando un equipo de investigadores chinos desarrollaron los primeros embriones humanos modificando genéticamente utilizando esta tecnología.

CRISPR, la nueva herramienta de modificación genética

CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) hace referencia a loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases, que se encuentran en el genoma de bacterias y otros microorganismos, confiriendo resistencia al organismo contra los virus (ver Figura 1).

En la Figura 1, las regiones CISPR se componen de repeticiones de cadenas cortas de ADN (diamantes negros) y espaciadores (rectángulos coloreados). Cuando un virus infecta a una bacteria, un nuevo espaciador procedente del virus se incorpora entre los espaciadores ya existentes. La secuencia de CRISPR se transcribe y se procesa para generar una secuencia corta de ARN CRISPR. El ARN CRISPR presenta proteínas de corte del ADN bacteriano (proteína Cas9) y se asocia a la correspondiente secuencia coincidente del virus invasor. La proteína Cas9 corta y destruye el genoma viral.

CRISPR se ha convertido en la última técnica de edición de genes, lo que permite realizar modificaciones precisas en los genes de la mosca de la fruta, de los peces, los ratones, las plantas y las células humanas. Para ello, el genetista tiene que diseñar y sintetizar una molécula corta de ARN que coincida con una secuencia específica de ADN. Entonces, como en la etapa de selección del sistema bacteriano, este ARN guía transfiere la proteína Cas9 al ADN objetivo, y puede silenciar un gen o cambiar la secuencia de un gen mediante la edición de una plantilla de reparación realizando una modificación específica en la secuencia, que se incorpora al ADN durante el proceso de reparación. El ADN objetivo resulta alterado para llevar a cabo la nueva secuencia ( véase Figura 2).

Los primeros embriones humanos modificados genéticamente se han desarrollado en China

Un equipo de investigadores de la Universidad de Sun Yat-sen en Guangzhou, China, ha utilizado la tecnología CRISPR para editar el gen HBB de la cadena β de la hemoglobina en embriones humanos preimplantados [2]. En realidad, el equipo de investigación utilizó embriones defectuosos, con tres pronúcleos que normalmente no se pueden implantar. Encontraron que CRISPR/Cas9 podría reducir con eficacia el gen HBB, pero la eficiencia de la recombinación homóloga para la reparación de HBB fue bastante baja y los embriones a los que se realizó la modificación genética resultaron con numerosas malformaciones (quimeras). También se observaron errores en la escisión. Además, el gen endógeno HDB de la hemoglobina, que es homólogo de HBB, entró en competencia con la secuencia exógena que actuaba como plantilla de reparación, dando lugar a mutaciones adversas. Los investigadores concluyeron:

“En conjunto, nuestro trabajo pone de manifiesto la urgente necesidad de mejorar la eficacia y especificidad de la plataforma CISPR/Cas9, un requisito previo para todas las aplicaciones clínicas de edición mediante CISPR/Cas9”.

Incluso antes de la publicación oficial del documento, dos grupos independientes de científicos escribieron editoriales en la revista Nature [3] y Science [4], expresando respectivamente sus preocupaciones. El grupo que escribió en la revista Nature [3] solicitaba una paralización de la edición de la línea germinal humana en base a que las modificaciones genéticas hereditarias plantean graves riesgos y los beneficios terapéuticos son escasos. También pondría en peligro los actuales esfuerzos para aplicar la tecnología de células somáticas como una potencial cura para el VIH/SIDA y la β–talasemia. Las investigaciones que utilizan la edición de genes en animales, tales como ratas, vacas, ovejas y cerdos, muestran que es posible eliminar o desactivar genes en un embrión, un proceso más simple que en realidad corrige o modifica la secuencia de ADN, pero solamente en algunas de las células. Los efectos precisos de la modificación genética de un embrión no se conocen hasta después del nacimiento, e incluso mucho después del nacimiento. La seguridad del paciente es la principal preocupación, antes de las consideraciones y preocupaciones éticas. Hoy en día, unos 40 países han establecido prohibiciones. 15 de las 22 naciones de Europa prohíben la modificación de la línea germinal. El Comité Asesor de ADN Recombinante del NIH estadounidense, afirma de forma explícita que “no contemplará propuestas de alteración de la línea germinal”. La mejora genética de carácter no terapéutico también es motivo de preocupación.

El grupo que publicó en Science [4] hace hincapié en que son necesarias investigaciones para entender y gestionar los riesgos derivados de la utilización de la tecnología CRISPR-Cas9. Entre sus consideraciones, incluyen la posibilidad de alteraciones y efectos no deseados. Es fundamental poner en práctica métodos estandarizados de evaluación comparativa para determinar la frecuencia de los efectos no deseados y para evaluar la fisiología de las células y de los tejidos que se han sometido a la edición de su genoma. Los posibles problemas de seguridad y su eficacia derivada de la utilización de esta tecnología deben ser investigados y comprendidos antes de llevar a cabo cualquier intento de ingería genética en los seres humanos.

Justo antes de una cumbre internacional celebrada en diciembre de 2015, copatrocinada por la Academia Nacional de Ciencias, la Academia Nacional de Medicina, la Royal Society del Reino Unido y la Academia de Ciencias de China, para considerar las implicaciones científicas y sociales de la edición del genoma, Jennifer Doudna, investigadora de la Universidad de California en Berkeley, que fue una de las que desarrolló la tecnología CRISPR/Cas9 y una de las firmantes en la revista Science, en un comentario hecho en Nature [5] afirmaba que :

“Todavía no sabemos lo suficiente sobre las capacidades y los límites de las nuevas tecnologías, sobre cuando se trata de realizar mutaciones hereditarias… La edición de la línea germinal humana para desarrollar seres humanos con su genoma modificado no se debe realizar de momento, en parte debido a las consecuencias sociales desconocidas, pero también porque la tecnología y el conocimiento del genoma humano es insuficiente para hacerlo con seguridad”. También dijo que las futuras discusiones deberían abordar otras aplicaciones potencialmente dañinas por la edición del genoma no humano, tales como “la alteración del ADN de los insectos para impulsar ciertos genes en una población” (ver más abajo).

En la cumbre internacional se hizo un llamamiento para actuar con más prudencia en las investigaciones relacionadas con las modificaciones hereditarias del genoma humano [6]. Aunque las Academias reconocieron que este tipo de investigaciones tienen el potencial de erradicar enfermedades genéticas o mejorar capacidades humanas, también se dijo que la Ciencia está todavía en mantillas como para hacer eso con seguridad o éxito.

Sin embargo, se argumentó que es buena idea utilizar células germinales o embriones humanos en la investigación básica y preclínica en el laboratorio, siempre y cuando no se utilicen para “determinar un embarazo”. (Esto supera lo que dijo Francis Collins, Directora de los Institutos Nacionales de Salud, de que el NIH no financiaría la edición del genoma con embriones humanos, incluso si no se utilizasen embriones para determinar un embarazo).

No todos los científicos están satisfechos con los resultados de esta cumbre [7]. Paul Knoepfler, Biólogo celular de la Universidad de California en Davis, dijo que estaba decepcionado de que los organizadores no propusieran al menos una moratoria temporal sobre la modificación genética de la línea germinal humana.

En enero de 2016, un equipo dirigido por Keith Joung, de la Escuela de Medicina de Harvard, Boston, Massachussetts, en Estados Unidos, informó de la construcción con éxito de una nucleasa CRISPR/Cas9 que no tiene efectos detectables fuera del genoma de destino. Esto se ha logrado mediante el cambio de 4 aminoácidos con cadenas laterales largas por uno con una cadena lateral corta (alanina) para reducir la interacción no específica de la proteína con la columna vertebral del fosfato del ADN. La nucleasa resultante, SpCas9-HF1 (Streptomyces pyogenes Cas9 de alta fidelidad) realiza funciones comparables a las enzimas de tipo salvaje, con un 85% del ARN guía (sg-ARN) probado en las células humanas, como muy pocos o nulos efectos no deseados. Se mejoró la especificidad de SpCas9-HF 1 y su potencial destino con otras sustituciones para reducir las interacciones no específicas con el ADN [8].

La reducción de los efectos no deseados contribuye sustancialmente a la seguridad. Pero aún es necesario abordar otros aspectos de seguridad, tales como las consecuencias no deseadas en el destino y la estabilidad de las modificaciones, así como las preocupaciones éticas.

Además, es motivo de preocupación otras aplicaciones que plantean nuevos retos en la seguridad, tales como la deriva genética (o meiótica) en insectos transgénicos.

Deriva genética en mosquitos transgénicos

La Organización Mundial de la Salud ha informado de que la mortalidad por la malaria continúa disminuyendo y se estima que alrededor de 3,3 millones de vidas se han salvado desde el año 2001 como resultado del desarrollo de nuevos medicamentos, medidas de protección, modificación del medio y otras medidas, pero todavía se produjeron unas 580.000 muertes por malaria a nivel mundial durante 2014 [9].

Investigadores de la Universidad de California en Irvine y San Diego acaban de desarrollar un mosquito transgénico para el control de los vectores de la malaria presentes en Anopheles stephensi portadores de genes contra la malaria producida por el patógeno Plasmodium falciparum usando CRISPR/Cas9, creando una unidad genética que produciría una progenie de mosquitos transgénicos macho anti-Plasmodium [10].

La deriva genética se trata en realidad de una reacción mutagénica en cadena, ideada en un principio en la Drosophila melanogaster [11] por dos investigadores de la Universidad de California en Irvine. La anterior edición del gen se realizó con Cas9 y el ARN guía y la secuencia del transgén en plásmidos separados. La ingeniería mediante Cas9 y ARN guía y la secuencia del transgén en un mismo plásmido, desencadena una reacción mutagénica que convierte el gen no modificado del cromosoma de tipo salvaje a estado mutante.

El Anopheles stephensi se estima que es responsable de aproximadamente el 12% de toda la transmisión en la India, sobre todo en los entornos urbanos, representando unos 106.000 casos clínicos durante 2014 [3]. Las cepas de laboratorio se transforman de forma eficiente con elementos de transposición para facilitar el análisis de la expresión del transgén en diversos lugares del genoma. La integración específica permite la inserción de ADN exógeno en el genoma del mosquito, en aquellos lugares con un mínimo impacto sobre la aptitud [12]. Por otra parte, se ha desarrollado un gen antiparasitario doble basándose en los anticuerpos de cadena simple MIC3 y m2A10, dirigidos a la proteína quitinasa 1 del oocineto de Plasmodium y a la proteína cricumsporozoito, respectivamente [13]. Las hembras de los mosquitos transgénicos que expresaron MIC3 y m2A10 estaban libres de esporozoitos de Plasmodium falciparum ( fase infecciosa del parásito) en sus glándulas salivales bajo las condiciones de infección que son de esperar en el medio y por lo tanto incapaces de transmitir el parásito. El modelado del sistema de transmisión de genes, que excede la herencia mendeliana, se traduce en una más rápida transformación de una población con un menor número de liberaciones que el enfoque de diseminación a gran escala, en la que los mosquitos diseñados (sin deriva genética) exceden sustancialmente a las poblaciones locales [14].

Todas estas consideraciones alentó a los investigadores a desarrollar un sistema de deriva genética en Anopheles stephensi usando CRISPR/Cas9, dirigida por reparación homóloga (HDR), una adaptación de la reacción en cadena mutagénica desarrollada en la mosca de la fruta. Este sistema se diseñó en ambas líneas germinales, tanto la masculina como la femenina procedente de los mosquitos transgénicos macho [10]. También es evidente que en las células somáticas de embriones derivados de las hembras transgénicas se obtuvo el gen Cas9. El sistema puede producir un número relativamente grande de genes ( aproximadamente 17kb de longitud).

La estructura del plásmido de la deriva genética está formada por el gen Cas9 y su promotor, el ARN guía y su promotor, los genes de anticuerpos duales con sus promotores y el gen marcador que codifica la proteína fluorescente roja de Drosophila (DsRed) con su promotor. Este largo tramo continuo está flanqueado por secuencias homólogas con destino al gen autosómico kh que codifican la enzima quinurenina hidroxilasa. En conjunto, el plásmido tiene una longitud de 21 kb con 16.625 bp de cargamento para ser insertado en el gen de destino.

Un total de 680 embriones en la fase G₀ fueron inyectados con el plásmido de transformación y otros componentes para ayudar a la transformación; 122 machos y 129 hembras sobrevivieron a la etapa adulta y se asignaron 22 machos promotores y 9 hembras promotoras que se cruzaron con adultos del tipo salvaje del sexo opuesto. Se detectaron positivos para DsRed en dos machos, designados 10.1 y 10.2, que se recuperaron después de evaluar 25.723 larvas en la fase G₁.

Del cruce con las hembras de tipo salvaje, 10.1 produjo toda una progenie adulta DsRed⁺ (n=14), mientras que 10.2 produjo sólo 57 de 129 (44%) de descendencia adulta con DsRed⁺ . Machos y hembras procedentes de 10.1 y 10.2 en la fase G₂ con DsRed⁺, se cruzaron con mosquitos de tipo salvaje y las larvas de la progenie de la fase G₃ se analizaron para comprobar la presencia de DsRed. La línea 10.1 produjo 1.321 (99,7%) con DsRed⁺ y la línea 10.2 produjo 4.631 (99,2%) con DsRed⁺ en las larvas de la fase G3. Estos resultados son consistentes con una alta eficiencia de la deriva genética.

Cuando los machos y las hembras de las líneas 10.1 y 10.2 de la fase G₃ se cruzaron con los mosquitos de tipo salvaje del sexo opuesto, la descendencia masculina y femenina de la fase G4 procedente de la fase G3, derivados de los machos transgénicos de la fase G2 de 10.1 y 10.2, mostraron una alta frecuencia en la transmisión del gen marcador que codifica la proteína fluorescente roja de Drosophila (DsRed), lo que se corresponde con una tasa de conversión de genes del 96,9%. En contraste, una proporción muy alta de machos de la fase G4 procedentes de larvas machos y hembras de la fase G3, derivados de las hembras transgénicas de la fase G2 de las líneas 10.1 y 10.2, parecen haber heredado mutaciones en el locus kh en lugar de una conversión de genes, con una tasa de 1.33 DsRed⁺ a 1.0 DsRed-. Esto indica que el transgén es inestable en la hembra y se presentan problemas de seguridad. (véase más adelante).

Es importante destacar que los genes anti-Plasmodium se transcriben activamente en los mosquitos DsRed^+.

La deriva genétiva, bajo escrutinio

Mucho antes de que se desarrollase el mosquito transgénico con deriva genética, un grupo de científicos ya expresaron sus preocupaciones por el vacío legal existentes con respecto a tales insectos [15]. Pusieron de relieve la necesidad de proveer medidas de contención y la posibilidad de dar marcha atrás en el proceso. Señalan que no se ha evaluado la seguridad de la deriva genética. Esta característica genética puede transmitirse sólo a una parte de la población antes de que una mutación inactive el rasgo introducido mediante ingeniería. (Este es el caso de la progenie transgénica del mosquito hembra, donde CRISPR/Cas también está presente en las células somáticas, véase más arriba). En algunos casos los fenotipos elegidos podrían mantenerse tanto tiempo como tardasen en aparecer nuevas versiones de deriva de la codificación.

Su comentario también hacía referencia a otro aspecto importante (pág. 627):

“En teoría, una deriva genética más precisa podría limitar la alteración de las poblaciones de destino, pero la fiabilidad de estos métodos, en prevención de su propagación a poblaciones no objetivo o relacionadas, requiere de una evaluación. ¿Hasta qué punto y en qué plazo de tiempo podría el cruzamiento o la transferencia horizontal de genes hacer que la deriva genética se extendiese más allá de las poblaciones objetivo? ¿Se podría recuperar posteriormente la capacidad de deriva en las poblaciones no inicialmente señaladas como objetivo?”.

Esto es algo crucial a raíz de la inestabilidad de la deriva genética en los mosquitos transgénicos hembra [10]. Cuando estas hembras inoculan a los animales, incluidos los seres humanos, hay posibilidad de una transferencia horizontal de genes de parte, o de toda la construcción de deriva genética, con efectos potencialmente graves sobre la salud animal y humana. La nucleasa Cas9 podría insertarse al azar o de otra manera en el genoma huésped, causando mutagénesis de inserción, que podría desencadenar cáncer o activar virus dominantes. Además, las numerosas transcripciones y productos genéticos codificados por la construcción de la deriva genética también podrían tener efectos nocivos, incluyendo reacciones inmunológicas. Ya se conocen algunos riesgos, más todavía en los animales que se alimentan de mosquitos, sobre todo ahora que sabemos que los ácidos nucleicos de los alimentos pueden penetrar en las células y tejidos (ver [16] Se confirma la presencia de ácidos nucleicos de los alimentos, SiS 63).

Por último, los riesgos ecológicos de la deriva genética son enormes, por lo que se han lanzado advertencias por parte de científicos conservacionistas de la Commonwealth Scientific de Australia y la Organización de Investigación Industrial [17]. Han afirmado: “La cuestión no es si podremos controlar las especies invasores mediante el deriva genética, si no si debemos hacerlo”. A medida que la deriva genética podría llevar a la extinción de una especie, lo cual podría ocurrir tanto en su hábitat natural como donde es considerada una especie invasiva. A diferencia del control biológico convencional, que puede ser aplicado a nivel local, no hay manera de controlar el flujo de genes. Señalan que debido a la deriva genética CISPR/Cas, sigue siendo totalmente funcional en la cepa mutada después de su desarrollo, de modo que la posibilidad de mutaciones no deseadas también se pueden dar y la probabilidad aumenta con cada generación sucesiva. “Si hay riesgo de transferencia de genes entre las especies objetivo y otras especies, entonces también hay riesgo de que la secuencia modificada puede también transferirse y manifestarse como un rasgo negativo en los organismos no objetivo”. (No se ha empezado a considerar el flujo de genes, lo que muchas veces multiplica los riesgos).

También hay una conciencia creciente de que muchas especies invasoras tendrán un considerable solapamiento de nicho ecológico, de tal manera que la eliminación de una especie permitiría a otra ocupar rápidamente su lugar.

Solicitan una exhaustiva evaluación del riesgo ecológico antes de cualquier aplicación de la deriva genética CRISP/Cas9; que se contemple el control de especies foráneas, para evitar que una “bala de plata” se convierta en una amenaza para la conservación”.

Para concluir

Hay muchas razones para proceder con precaución en las aplicaciones de CRISPR/Cas9. Es una herramienta de edición de genes de amplio alcance, eficiente, barata y plagada de riesgos para la salud y el medio ambiente. Particularmente preocupante en su uso para la deriva genética, un proceso actualmente irreversible e incontrolable, una vez liberados al medio ambiente.

Referencias

1. This account is modified from “CRISPR: a game-changing genetic engineering technique”, SITNFlash, SITN, Harvard University, http://sitn.hms.harvard.edu/
2. Liang P, Xu Y, Zhang X et al, Zhou C and Huang J. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein & Cell 2015, 6, 363-372.
3. Lanphier E, Urnov F, Haecker SE, Werner M and Smolenski J. Don’t edit the human germ line. Nature, 12 March 2015, http://www.nature.com/news/don-t-edit-the-human-germ-line-1.17111#/
4. Baltimore D, Berg P, Botchan M, Carroll D, Charo RA, Church G, and 11 more. A prudent path forward for genomic engineering and germline genetic modification. Science 2015, 348, 36-38.
5. Doudna J. Perspective: Embryo editing needs scrutiny. Nature 528, S6 (3 December 2015) doi:10.1038/528S6a
6. “Why scientists are calling for caution on a powerful new gene-editing technology”, Julia Belluz, Vox Science & Health, 3 December 2015, http://www.vox.com/2015/12/3/9845230/crispr-gene-editing-caution
7. “Summit agrees genome editing to proceed, with caution”, Jane Currie, BioNews, 7 December 2015, http://www.bionews.org.uk/page_594243.asp
8. Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, Tsai SQ, Nguyen NT, Zheng Z and Joung JK. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature 2016,  doi:10.1038/nature16526
9. World Health Organization (2015) World Malaria Report, 2014 (WHO, Geneva, Switzerland/
10. Gantz VM, Jasinskiene N, Tatarenkova L, Fazekas A, Madas VM, Bier E and James AA. Population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. PNAS Early Edition, 26 October 2015, www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1521077112
11. Gantz VM and Bier E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science 2015, 348, 442-444.
12. Amenya DA, Bonizzoni M, Isaacs AT, Jasinskiene N, Chen H, Marinotti O, Yan G and James AA. Comparative fitness assessment of Anopheles stephensi transgenic lines receptive to site-specific integration. Insect Mol Biol 2010, 19, 263–269.
13. Isaacs AT, Jasinskiene N, Tretiakov M, Thiery I, Zettor A, Gourgouin C and James AA. Transgenic Anopheles stephensi coexpressing single-chain antibodies resist Plasmodium falciparum development. Proc Natl Acad Sci USA 2012, 109, E1922–E1930.
14. Robert MA, Okamoto KW, Gould F and Lloyd AL. Antipathogen genes and the replacement of disease-vectoring mosquito populations: A model-based evaluation. Evol Appl 2014, 7, 1238–1251.
15. Oye KA, Esvelt K, Appleton E, Catterueda F, Church G. et al. Regulating gene drives. Science 2014, 348, 626-628.
16. Ho MW. Nucleic acid invaders from food confirmed. Science in Society 63, 24-25, 2014.
17. Webber BL, Raghu S and Edwards OR. Opinion: Is CRISPR-based gene drive a biocontrol silver bullet or global conservation threat? PNAS 2015, 111, 10565-7.

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Procedencia del artículo:

http://www.i-sis.org.uk/CRISPR_too_fast_for_comfort.php

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