Por Claire Robinson, 4 de julio de 2017
Dos empresas de edición de genes están rebatiendo un artículo científico [1] que provocó la caída de sus acciones, alegando que contiene una gran cantidad de errores y que no debería haber sido publicado. En las cartas enviadas a Nature Methods, los representantes de Intellia Therapeutics y Editas Medicine criticaron el artículo, en el que se decía que la herramienta de edición del genoma CRISPR había provocado una serie de mutaciones inesperadas en el genoma de los ratones [2]. Supongo que los lectores ya estarán familiarizados con estas formas de proceder: el Director General de una de las empresas incluso ha exigido la retractación del artículo publicado en la revista.
Pero los descubrimientos de los que se informa en el artículo, conjuntamente con otros trabajos de investigación recientemente publicados, hablan de efectos no deseados de la edición de genes CRISPR. Las empresas estarían argumentando desde un lado que nada tiene que ver con el conocimiento científico.
Un estudio que perjudica los intereses de las empresas
En la carta de Intellia se dice que las explicaciones ofrecidas por los autores del artículo sobre los efectos inesperados en el genoma de los ratones “requiere de una actividad de Cas9 que no se sabía que tuviera”. El Presidente Ejecutivo de Intellia, Nessan Bermingham, dijo a Technology Review:
“Esta publicación ha conseguido ser el centro de atención de los medios y del público, provocando un daño significativo. Teniendo en cuenta las cuestiones relativas a su diseño e interpretación, creo que sería apropiado que el consejo editorial de Nature Methods retire dicho artículo”.
Retraction Watch comentó:
“Esta no es la primera vez que vemos a Corporaciones que solicitan la retractación de artículos que no les favorecen en sus ingresos”.
Mutaciones inesperadas
GMWatch ya informó sobre el artículo científico en el mes de junio. El artículo informaba de los descubrimientos por el uso de CRISPR, que trataba de desarrollar ratones modificados genéticamente mediante inyección en óvulos fertilizados, provocando unas mutaciones inesperadas, no sólo en cantidad sino también en calidad. No sólo el número de mutaciones fue mucho mayor de lo esperado, acercándose a más de mil, sino que la mayoría de las mutaciones resultantes del proceso CRISPR era de un tipo del que nunca se había informado antes.
Ninguna de estas mutaciones del ADN se encontraron en lugares pronosticados por los programas informáticos, que son muy utilizados por los investigadores para examinar el genoma de un organismo para buscar posibles efectos fuera del objetivo establecido por la técnica CRISPR. Entre las 50 secuencias pronosticadas como fuera de objetivo, que dedujo el programa informático, ninguno hablaba de estas mutaciones.
Los investigadores secuenciaron todo el genoma de los ratones transgénicos e identificaron todas las mutaciones. Encontraron que un número de mutaciones, 164 y 128 respectivamente en cada uno de los dos ratones en los que se realizó la edición de su genoma, fueron del tipo esperado: inserciones o deleciones (eliminaciones) de unidades base del ADN que apuntaban al sitio objetivo de CRISPR. La mayoría de las mutaciones identificadas, 1736 y 1696 respectivamente en cada ratón, fueron alteraciones de unidades base de ADN. Esto significa que un tipo de unidad base había sido reemplazado por otro, dando lugar a lo que se conoce como una variación de nucleótido único o SNV.
Además, la gran mayoría de las mutaciones asociadas a CRISPR, 117 deleciones y 1397 variaciones del nucleótido, fueron las mismas en los dos animales modificados genéticamente. Esto indica un proceso selectivo y no aleatorio. La tasa de mutaciones provocada por CRISPR fue mucho mayor que la tasa natural de mutaciones del genoma en los ratones. Una comparación con la base de datos de variación del genoma del ratón, elaborada a partir del estudio de 36 cepas de ratón, encontró que ninguna de las variaciones de los nucleótidos en los ratones transgénicos estaba presente en ninguna de estas cepas. Esto muestra claramente que las variaciones de los nucleótidos fueron resultado de la técnica CRISPR, unos efectos no esperados.
Unos efectos desconocidos de CRISPR
Comentando estos descubrimientos, el Dr. Michael Antoniou, genetista molecular que reside en Londres, dijo:
“La aparición de mutaciones SNV inducidas por CRISPR fue algo totalmente inesperado, ya que actualmente no se conoce ningún mecanismo por el cual esta herramienta de edición del genoma pueda producir variaciones en los nucleótidos. Esto quiere decir que CRISPR puede poseer unos mecanismos moleculares de acción que provocan unas reacciones hasta desconocidas en el genoma”.
“Esto nos dice que es posible que no sepamos todo sobre los mecanismos de acción del sistema CRISPR-Cas9”.
Intella responde
En su respuesta al artículo científico, Intella sugiere que los SNV no fueron provocados por CRISPR sino por un proceso natural llamado desaminación espontánea.
La desaminación supone la eliminación de un grupo amino de una molécula por unas enzimas conocidas como desaminasas. Puede tener lugar tanto en las proteínas como en el ADN. Dependiendo de la unidad base del ADN que ha sido sometida a desaminación, puede resultar en la reparación del daño o en la sustitución de una unidad base del ADN por otra. El cuerpo utiliza la desaminación para descomponer el exceso de proteínas y así generar energía. A nivel del ADN, se cree que la desaminación da un impulso a la variación genética en un contexto evolutivo.
Comentando la hipótesis de Intellia, el Dr. Antoniou dijo:
“Es muy improbable que el proceso de desaminación se produjera exactamente en los mismos sitios en dos ratones transgénicos desarrollados de manera independiente, como se vio en el estudio.
Además, si lo sitios donde se produjo la variación de nucleótidos eran naturalmente propensos a este tipo de modificaciones, entonces estarían presentes en la base de datos del genoma del ratón. Esto indica con claridad que son nuevos y están relacionados con el proceso de modificación genética”.
Se podría ampliar el estudio
Para aquellos que todavía duden de que la tecnología CRISPR, que supuestamente es muy precisa, pueda resultar en tantos efectos inesperados, el Dr. Antoniou dice que sería relativamente fácil repetir el estudio usando más ratones y secuenciando el genoma de los padres. Esto abordaría las objeciones de los críticos de que:
– Fueron muy pocos los ratones utilizados en el estudio (dos ratones en los que se realizó la edición de genes, más uno de control).
– Los genomas de los padres debían de haber sido secuenciados y utilizados como control, en lugar de un ratón en el que no se realizó edición de sus genes y una relación desconocida con los ratones en los que sí se hizo dicha edición de genes.
– Las mutaciones fueron el resultado de procesos naturales y no de CRISPR.
Sin embargo, la posibilidad de que otros estudios arrojen más luz sobre estos descubrimientos no es razón para que se produzca una retracción de la publicación del estudio o de cualquier otro.
Otro estudio encuentra efectos no deseados de CRISPR
Otros descubrimientos realizados en una reciente investigación confirman que no se puede decir que CRISPR sea una técnica muy precisa y predecible.
Un estudio realizado por otro grupo de investigadores [3] examinó las secuencias moleculares de 17 eventos realizados mediante CRISPR en cuatro regiones diferentes del genoma del ratón.
Los investigadores encontraron que la edición de genes CRISPR dio lugar a tipos inesperados de delaciones en los 17 sitios del genoma del ratón.
Esto supuso una sorpresa, ya que los mecanismos de reparación del ADN después del corte del ADN mediante CRISPR (en los lugares conocidos como unión final no homóloga) se creía que generalmente daba como resultado aproximadamente nueve supresiones o inserciones de unidades base. Sin embargo, los autores encontraron que dependiendo del sitio al que se dirigían, el tamaño de la deleción era mayor de lo esperado, hasta 600 unidades base del ADN. Este fue particularmente lo que ocurrió cuando se dirigían a los lugares de repetición del ADN, es decir, tramos de ADN donde se producen repeticiones en la secuencia de ADN.
Además, los autores demostraron por primera vez que la deleción resultante de la reparación del ADN estaba asimétricamente localizada en comparación con el sitio de corte de CRISPR. Esto significa que estaba casi invariablemente situado tanto arriba como por abajo del lugar de corte, en lugar de producirse simétricamente, como se suponía anteriormente.
Tales elevadas supresiones de un único corte producido mediante CRISPR no se había definido claramente en estudios anteriores. Los autores mencionan que esto se debió a que la tecnología que generalmente se utiliza para determinar la extensión de una deleción (conocida como reacción en cadena de la polimerasa o PCR) no se había aplicado apropiadamente. Es decir, el análisis mediante PCR se utilizó de una manera que sólo detecta pequeñas deleciones.
Este fracaso analítico tiene dos consecuencias:
1.- La alteración que se persigue de una región del genoma podría haber sido mucho más extensa de lo previsto, y por lo tanto haber provocado daños inesperados en elementos del genoma, por ejemplo, secciones de genes objetivo, genes vecinos al sitio objetivo o sus elementos reguladores.
2.- Las enormes deleciones habrían pasado desapercibidas.
Los autores recomendaron que la secuenciación completa del genoma se hace necesaria para buscar estos efectos no intencionales, en lugar de la técnica PCR estándar, que podría dar lugar a que muchos procesos pasasen inadvertidos.
Un tercer estudio también encuentra inusitadas deleciones
Otro estudio recientemente publicado [4] también ha encontrado un número elevado de deleciones inesperadas inducidas por los cortes de la técnica CRISPR, en algunos casos por encima de las 500 unidades base de ADN. En algunos de estos casos, se suprimieron subregiones de genes (exones) que llevan la información para la codificación de las proteínas. Esto provocó la formación de nuevas estructuras de genes que codificaban unas formas truncadas de proteínas.
A nivel de todo el organismo, tales proteínas podrían ser benignas o dañinas.
Implicaciones para la seguridad alimentaria
Estos tres estudios ponen de manifiesto unos resultados inesperados de la edición del genoma. Si esto ocurriera en la nueva generación de cultivos y alimentos producidos mediante la edición de su genoma, podría resultar en alteraciones de muchas funciones genéticas, además de otros cambios no deseados, tales como la alteración de la bioquímica de la planta, lo cual puede acarrear una toxicidad inesperada o alergenicidad.
Por lo tanto, los alimentos modificados genéticamente deben analizarse con tecnologías “ómicas” (transcriptómica para observar la expresión génica, metabolómica para observar los metabolitos y proteómica para observar el perfil proteínico). El objetivo es determinar los cambios producidos en el genoma de la planta, tanto a nivel del ADN como a nivel de la función genética. Además, estos alimentos deben someterse a pruebas de toxicidad y alergenicidad en estudios a largo plazo.
Hasta que tales estudios sean realizados, nadie puede afirmar que la tecnología CRISPR es segura, precisa y predecible.
Comparación con otras herramientas de edición de genes
La principal razón por la que se están publicando más artículos sobre los efectos inesperados de CRISPR que de otras herramientas de ediciones de genes es debido a su rápida asimilación, por el hecho de que es barata, rápida y fácil de aplicar. Incluso un grupo con pocos recursos financieros puede utilizarla. Está siendo utilizada por investigadores médicos que esperan desarrollar terapias genéticas contra las enfermedades, así como por biotecnólogos de las plantas.
Pero ¿podrían otras herramientas de edición de genes, tales como ZFN y TALEN, producir también deleciones en el lugar de corte del ADN?
El Dr. Antoniou cree que esto es probable. Esto se debe a que una herramienta de edición de genes, ya sea CRISPR, ZFN o TALEN, que haya realizado un corte en el ADN, provoca un proceso celular natural, tal como la unión de extremos no homólogos, intentando reparar el ADN uniendo los extremos cortados. Durante este proceso, se pueden producir un número muy elevado de deleciones e inserciones. Y claro, esto ocurrirá independientemente de la herramienta que se haya usado para cortar el ADN.
El Dr. Antoniou dijo:
“Con toda probabilidad, los sistemas ZFN y TALEN también producirán algunos casos de supresiones inesperadas en el sitio elegido para el corte. No sabemos con seguridad lo que va a ocurrir, porque los investigadores no han examinado el alcance de las supresiones en los sitios de destino de la misma manera que recientemente se ha informado por la tecnología CRISPR”.
Mientras esperamos que nos lleguen los datos, no podemos permitirnos que empresas como Intellia eliminen una información científica de los registros, simplemente porque daña su línea de negocio.
Referencias
1. Schaefer KA et al (2017). Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo. Nature Methods 14, 547–548. doi:10.1038/nmeth.4293
2. Genome = the total DNA base unit sequence.
3. Shin HY et al. (2017). CRISPR/Cas9 targeting events cause complex deletions and insertions at 17 sites in the mouse genome. Nature Communications 8, Article number: 15464. doi:10.1038/ncomms15464
4. Mou H et al. (2017). CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by alternative splicing or exon deletion. Genome Biology 18:108. DOI: 10.1186/s13059-017-1237-8.
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